课程大纲

Syllabus

基本信息

项目	内容
课程名称	转录组数据分析
英文名称	RNA-seq Data Analysis
授课对象	生物医学信息系本科生/研究生
先修课程	R与(R)Markdown基础、生物统计学
学时安排	4学时（2学时理论 + 2学时实验）
授课教师	王诗翔副教授
开课单位	中南大学

学时说明：每学时 = 45分钟

课程目标

完成本课程后，学生将能够：

知识目标

理解RNA-seq技术原理、实验流程和数据特点
掌握转录组数据从原始FASTQ到表达矩阵的处理流程
理解差异表达分析的统计原理（负二项分布、离散度估计）
了解功能富集分析的算法（ORA超几何检验、GSEA）和常用数据库

能力目标

能够使用DESeq2进行完整的差异表达分析流程
能够进行火山图、热图等结果可视化
能够使用clusterProfiler进行GO/KEGG富集分析
能够解释分析结果并撰写简要报告

素质目标

建立转录组研究的系统性分析思维
培养生物信息学数据质量控制意识
增强生物学结果解释和文献阅读能力

教学内容与时间安排

理论讲授（2学时 = 90分钟）

序号	主题	核心内容	重点/难点	时长
1	RNA-seq原理与实验设计	测序原理；文库制备；实验设计原则；批次效应控制	重点：实验设计原则、批次效应控制难点：批次效应的识别与控制	25分钟
2	数据预处理与质控	FASTQ格式；FastQC质控；比对原理；表达定量；标准化方法	重点：质控指标解读、标准化原理难点：TPM vs FPKM vs Size Factors	25分钟
3	差异表达分析	负二项分布；DESeq2流程；多重检验校正	重点：DESeq2分析步骤、结果筛选标准难点：离散度估计、log2FC收缩	25分钟
4	功能富集分析	GO/KEGG数据库；ORA超几何检验；GSEA原理；结果可视化	重点：ORA原理、clusterProfiler使用难点：GSEA原理、结果生物学解释	15分钟

合计：2学时（90分钟）

实验教学（2学时 = 90分钟）

序号	实验名称	核心内容	关键技能	时长
1	RNA-seq数据质控与预处理	DESeq2对象创建；低表达基因过滤；Size Factor计算；VST转换；PCA与样本相关性	DESeqDataSet构建、数据过滤、标准化	45分钟
2	差异表达分析与可视化	DESeq2差异分析；结果筛选；火山图；热图；GO富集分析	results()使用、ggplot2可视化、clusterProfiler	45分钟

合计：2学时（90分钟）

总计：4学时（180分钟）

关键知识点总结

🔑 核心理论要点

1. RNA-seq数据统计特性

计数数据特点：
- 非负整数（离散型）
- 方差 > 均值（过度离散）
- 适合负二项分布建模

2. 标准化方法对比

方法	适用场景	特点
Size Factor	差异分析	DESeq2内置，中位数比值法
TPM	样本内基因比较	长度校正，和为10^6
CPM	可视化	简单标准化

3. 差异基因筛选标准

推荐阈值：
- |log2FoldChange| > 1  （倍数变化 > 2）
- padj < 0.05  （FDR < 5%）

注意：padj是BH校正后的p值，非原始p值

4. 功能富集分析原理

ORA超几何检验：
P(X=k) = C(M,k) × C(N-M, n-k) / C(N,n)

其中：N=背景基因，M=通路基因，n=差异基因，k=重叠基因

关键难点与易错点

⚠️ 常见错误

环节	常见错误	正确做法
实验设计	对照组和处理组分不同批次处理	块设计：每批次包含各组样本
数据输入	使用标准化后的数据做DESeq2	DESeq2需要原始counts矩阵
结果筛选	使用pvalue而非padj	必须使用padj（BH校正）
富集分析	使用全部基因做背景	背景应为所有检测到的基因
可视化	热图使用原始counts	热图应使用标准化/转换后的数据

🔍 质控关键指标

指标	合格标准	不合格处理
Q30	> 85%	检查测序质量
唯一比对率	> 70%	检查参考基因组
样本间相关性	组内 > 组间	检查批次效应
PCA分组	按生物学条件聚类	检查批次或异常样本

软件环境

必需R包

# Bioconductor包
BiocManager::install(c(
  "DESeq2",           # 差异表达分析
  "clusterProfiler",  # 功能富集
  "org.Hs.eg.db",     # 人类基因注释
  "org.Mm.eg.db",     # 小鼠基因注释
  "enrichplot"        # 富集可视化
))

# CRAN包
install.packages(c(
  "ggplot2",          # 绘图
  "pheatmap",         # 热图
  "RColorBrewer",     # 配色
  "tidyverse"         # 数据处理
))

版本要求

R >= 4.3.0
Bioconductor >= 3.18

参考教材与资源

主要教材

《RNA-seq Data Analysis: A Practical Approach》
- Eija Korpelainen et al., CRC Press, 2014
DESeq2 Vignette (必读)
- https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html
clusterProfiler文档 (必读)
- https://yulab-smu.top/biomedical-knowledge-mining-book/

在线资源

资源	链接	说明
Bioconductor RNA-seq Workflow	链接	官方完整流程
HBC RNA-seq Training	GitHub	哈佛培训材料
NBIS RNA-seq Workshop	GitHub	瑞典国家生物信息学课程

课程拓展

本课程是生物医学信息系课程体系的核心模块：

后续课程	衔接内容
单细胞RNA-seq分析	单细胞数据质控、降维、聚类
整合多组学分析	多组学数据整合与网络分析
生物信息学综合实践	完整项目设计与实施

学术诚信

本课程要求严格遵守学术诚信规范：

实验报告独立完成，禁止抄袭代码
引用他人代码需明确标注来源
鼓励合作讨论分析方法，但禁止直接复制分析结果
违反者按学校规定处理

联系信息

授课教师：王诗翔副教授
单位：中南大学 · 生物医学信息系
邮箱：wangshx@csu.edu.cn
实验室主页：https://wanglabcsu.github.io/
GitHub：https://github.com/WangLabCSU

祝学习愉快！ 🎉

--- title: "课程大纲" subtitle: "Syllabus" --- ## 基本信息 | 项目 | 内容 | |------|------| | **课程名称** | 转录组数据分析 | | **英文名称** | RNA-seq Data Analysis | | **授课对象** | 生物医学信息系本科生/研究生 | | **先修课程** | R与(R)Markdown基础、生物统计学 | | **学时安排** | **4学时**（2学时理论 + 2学时实验）| | **授课教师** | 王诗翔副教授 | | **开课单位** | 中南大学 | **学时说明**：每学时 = 45分钟 --- ## 课程目标完成本课程后，学生将能够： ### 知识目标 - 理解RNA-seq技术原理、实验流程和数据特点 - 掌握转录组数据从原始FASTQ到表达矩阵的处理流程 - 理解差异表达分析的统计原理（负二项分布、离散度估计） - 了解功能富集分析的算法（ORA超几何检验、GSEA）和常用数据库 ### 能力目标 - 能够使用DESeq2进行完整的差异表达分析流程 - 能够进行火山图、热图等结果可视化 - 能够使用clusterProfiler进行GO/KEGG富集分析 - 能够解释分析结果并撰写简要报告 ### 素质目标 - 建立转录组研究的系统性分析思维 - 培养生物信息学数据质量控制意识 - 增强生物学结果解释和文献阅读能力 --- ## 教学内容与时间安排 ### 理论讲授（2学时 = 90分钟） | 序号 | 主题 | 核心内容 | 重点/难点 | 时长 | |:----:|------|----------|-----------|:----:| | 1 | **RNA-seq原理与实验设计** | 测序原理；文库制备；实验设计原则；批次效应控制 | **重点**：实验设计原则、批次效应控制<br>**难点**：批次效应的识别与控制 | 25分钟 | | 2 | **数据预处理与质控** | FASTQ格式；FastQC质控；比对原理；表达定量；标准化方法 | **重点**：质控指标解读、标准化原理<br>**难点**：TPM vs FPKM vs Size Factors | 25分钟 | | 3 | **差异表达分析** | 负二项分布；DESeq2流程；多重检验校正 | **重点**：DESeq2分析步骤、结果筛选标准<br>**难点**：离散度估计、log2FC收缩 | 25分钟 | | 4 | **功能富集分析** | GO/KEGG数据库；ORA超几何检验；GSEA原理；结果可视化 | **重点**：ORA原理、clusterProfiler使用<br>**难点**：GSEA原理、结果生物学解释 | 15分钟 | **合计：2学时（90分钟）** ### 实验教学（2学时 = 90分钟） | 序号 | 实验名称 | 核心内容 | 关键技能 | 时长 | |:----:|----------|----------|----------|:----:| | 1 | **RNA-seq数据质控与预处理** | DESeq2对象创建；低表达基因过滤；Size Factor计算；VST转换；PCA与样本相关性 | DESeqDataSet构建、数据过滤、标准化 | 45分钟 | | 2 | **差异表达分析与可视化** | DESeq2差异分析；结果筛选；火山图；热图；GO富集分析 | results()使用、ggplot2可视化、clusterProfiler | 45分钟 | **合计：2学时（90分钟）** **总计：4学时（180分钟）** --- ## 关键知识点总结 ### 🔑 核心理论要点 #### 1. RNA-seq数据统计特性 ``` 计数数据特点： - 非负整数（离散型） - 方差 > 均值（过度离散） - 适合负二项分布建模 ``` #### 2. 标准化方法对比 | 方法 | 适用场景 | 特点 | |------|----------|------| | **Size Factor** | 差异分析 | DESeq2内置，中位数比值法 | | **TPM** | 样本内基因比较 | 长度校正，和为10^6 | | **CPM** | 可视化 | 简单标准化 | #### 3. 差异基因筛选标准 ``` 推荐阈值： - |log2FoldChange| > 1 （倍数变化 > 2） - padj < 0.05 （FDR < 5%）注意：padj是BH校正后的p值，非原始p值 ``` #### 4. 功能富集分析原理 ``` ORA超几何检验： P(X=k) = C(M,k) × C(N-M, n-k) / C(N,n) 其中：N=背景基因，M=通路基因，n=差异基因，k=重叠基因 ``` --- ## 关键难点与易错点 ### ⚠️ 常见错误 | 环节 | 常见错误 | 正确做法 | |------|----------|----------| | **实验设计** | 对照组和处理组分不同批次处理 | 块设计：每批次包含各组样本 | | **数据输入** | 使用标准化后的数据做DESeq2 | DESeq2需要原始counts矩阵 | | **结果筛选** | 使用pvalue而非padj | 必须使用padj（BH校正） | | **富集分析** | 使用全部基因做背景 | 背景应为所有检测到的基因 | | **可视化** | 热图使用原始counts | 热图应使用标准化/转换后的数据 | ### 🔍 质控关键指标 | 指标 | 合格标准 | 不合格处理 | |------|----------|------------| | Q30 | > 85% | 检查测序质量 | | 唯一比对率 | > 70% | 检查参考基因组 | | 样本间相关性 | 组内 > 组间 | 检查批次效应 | | PCA分组 | 按生物学条件聚类 | 检查批次或异常样本 | --- ## 软件环境 ### 必需R包 ```r # Bioconductor包 BiocManager::install(c( "DESeq2", # 差异表达分析 "clusterProfiler", # 功能富集 "org.Hs.eg.db", # 人类基因注释 "org.Mm.eg.db", # 小鼠基因注释 "enrichplot" # 富集可视化 )) # CRAN包 install.packages(c( "ggplot2", # 绘图 "pheatmap", # 热图 "RColorBrewer", # 配色 "tidyverse" # 数据处理 )) ``` ### 版本要求 - R >= 4.3.0 - Bioconductor >= 3.18 --- ## 参考教材与资源 ### 主要教材 1. **《RNA-seq Data Analysis: A Practical Approach》** - Eija Korpelainen et al., CRC Press, 2014 2. **DESeq2 Vignette** (必读) - https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html 3. **clusterProfiler文档** (必读) - https://yulab-smu.top/biomedical-knowledge-mining-book/ ### 在线资源 | 资源 | 链接 | 说明 | |------|------|------| | Bioconductor RNA-seq Workflow | [链接](https://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/html/rnaseqGene.html) | 官方完整流程 | | HBC RNA-seq Training | [GitHub](https://github.com/hbctraining/Intro-to-rnaseq-hpc-O2) | 哈佛培训材料 | | NBIS RNA-seq Workshop | [GitHub](https://github.com/NBISweden/workshop-RNAseq) | 瑞典国家生物信息学课程 | --- ## 课程拓展本课程是生物医学信息系课程体系的核心模块： | 后续课程 | 衔接内容 | |----------|----------| | **单细胞RNA-seq分析** | 单细胞数据质控、降维、聚类 | | **整合多组学分析** | 多组学数据整合与网络分析 | | **生物信息学综合实践** | 完整项目设计与实施 | --- ## 学术诚信本课程要求严格遵守学术诚信规范： - 实验报告独立完成，禁止抄袭代码 - 引用他人代码需明确标注来源 - 鼓励合作讨论分析方法，但禁止直接复制分析结果 - 违反者按学校规定处理 --- ## 联系信息 - **授课教师**：王诗翔副教授 - **单位**：中南大学 · 生物医学信息系 - **邮箱**：wangshx@csu.edu.cn - **实验室主页**：https://wanglabcsu.github.io/ - **GitHub**：https://github.com/WangLabCSU --- **祝学习愉快！** 🎉