第1讲：RNA-seq原理与实验设计

从mRNA到序列数据

本讲概述

学习目标： - 理解RNA-seq技术的核心原理和优势 - 掌握实验设计的基本原则 - 理解批次效应的来源与控制方法

重点难点： - 🔑 重点：实验设计原则、批次效应控制 - ⚠️ 难点：批次效应的识别与控制策略

1. RNA-seq技术简介

1.1 什么是RNA-seq？

RNA-seq（RNA sequencing） 是利用高通量测序技术对转录组进行定量和定性分析的方法。

1.2 RNA-seq vs 芯片技术

特性	RNA-seq	芯片
检测范围	全转录组（已知+未知）	预设探针
动态范围	宽（>10⁴）	窄（~10²）
灵敏度	高	中等
发现能力	新转录本、融合基因	限于已知

提示

结论：RNA-seq已成为转录组研究的标准方法

2. RNA-seq实验流程

2.1 整体流程

样本采集 → RNA提取 → mRNA富集 → 片段化 → cDNA合成 → 接头连接 → 测序 → 数据分析

2.2 关键质控点

阶段	指标	要求
RNA提取	RIN值	> 7
文库构建	片段大小	200-300 bp
测序	Q30	> 85%

2.3 mRNA富集策略

方法	适用	优点	缺点
poly-A选择	完整RNA+真核生物	数据利用率高	丢失非编码RNA
rRNA去除	降解样本/原核生物	更全面	rRNA残留可能高

3. 测序参数选择

3.1 测序模式

模式	读长	应用场景
SE50	50 bp单端	仅表达定量
PE100	100 bp双端	剪接分析（推荐）
PE150	150 bp双端	复杂转录组

3.2 测序深度与重复数

分析类型	reads/样本	生物学重复
基因表达定量	10-30 M	n≥3（最低）
差异剪接	50-100 M	n≥4

重要

黄金法则：生物学重复 > 测序深度

4. 实验设计原则 🔑

4.1 基本原则

1. 对照组设置 — 必须设置对照组
2. 随机化 — 样本处理顺序随机
3. 平衡设计 — 各组样本数相等
4. 盲法 — 减少操作偏差
5. 详细记录 — 批次、日期、操作者

4.2 常见实验设计

两两比较（最常见）：

对照组 (n=3)    vs    处理组 (n=3)
   ↓                    ↓
建库测序            建库测序
   ↓                    ↓
   ←—— 差异分析 ——→

配对设计：

同一患者：治疗前 (n=20) vs 治疗后 (n=20)
        ↓
配对分析：考虑个体差异，提高统计效能

4.3 实验设计检查清单

每组至少3个生物学重复？
是否考虑了性别、年龄等混杂因素？
是否记录了批次信息？
是否进行了随机化处理？

5. 批次效应 ⚠️

5.1 什么是批次效应？

批次效应：由非生物学因素引起的系统性差异

来源	影响程度
操作者	高
时间	高
试剂批次	中
仪器	中

5.2 识别方法

PCA：批次是否聚类在一起
热图聚类：样本是否按批次聚类

异常表现：❌ 样本按批次聚类，而非生物学分组

5.3 控制策略

设计阶段控制（首选）：

✅ 推荐：块设计（Block Design）

Day 1: 对照1-3 + 处理1-3
Day 2: 对照4-6 + 处理4-6

❌ 避免：
Day 1: 所有对照组
Day 2: 所有处理组

6. 本讲小结

要点	内容
技术优势	全转录组覆盖、高灵敏度、发现新转录本
测序参数	PE100-150，10-30M reads/样本，n≥3
实验设计	对照组、随机化、平衡设计、详细metadata
批次效应	设计阶段控制优于分析阶段校正

思考题

为什么选择poly-A富集而非随机引物？
双端测序相比单端测序的优势是什么？
如何判断实验中是否存在批次效应？
单细胞RNA-seq与常规RNA-seq在设计上的主要区别？

参考文献

Wang Z, et al. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009
Conesa A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016
Leek JT, et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects. Nat Rev Genet. 2010

--- title: "第1讲：RNA-seq原理与实验设计" subtitle: "从mRNA到序列数据" --- ## 本讲概述 **学习目标**： - 理解RNA-seq技术的核心原理和优势 - 掌握实验设计的基本原则 - 理解批次效应的来源与控制方法 **重点难点**： - 🔑 **重点**：实验设计原则、批次效应控制 - ⚠️ **难点**：批次效应的识别与控制策略 --- ## 1. RNA-seq技术简介 ### 1.1 什么是RNA-seq？ **RNA-seq（RNA sequencing）** 是利用高通量测序技术对转录组进行定量和定性分析的方法。 ### 1.2 RNA-seq vs 芯片技术 | 特性 | RNA-seq | 芯片 | |------|---------|------| | 检测范围 | 全转录组（已知+未知） | 预设探针 | | 动态范围 | 宽（>10⁴） | 窄（~10²） | | 灵敏度 | 高 | 中等 | | 发现能力 | 新转录本、融合基因 | 限于已知 | ::: {.callout-tip} **结论**：RNA-seq已成为转录组研究的**标准方法** ::: --- ## 2. RNA-seq实验流程 ### 2.1 整体流程 ``` 样本采集 → RNA提取 → mRNA富集 → 片段化 → cDNA合成 → 接头连接 → 测序 → 数据分析 ``` ### 2.2 关键质控点 | 阶段 | 指标 | 要求 | |------|------|------| | RNA提取 | RIN值 | > 7 | | 文库构建 | 片段大小 | 200-300 bp | | 测序 | Q30 | > 85% | ### 2.3 mRNA富集策略 | 方法 | 适用 | 优点 | 缺点 | |------|------|------|------| | **poly-A选择** | 完整RNA+真核生物 | 数据利用率高 | 丢失非编码RNA | | **rRNA去除** | 降解样本/原核生物 | 更全面 | rRNA残留可能高 | --- ## 3. 测序参数选择 ### 3.1 测序模式 | 模式 | 读长 | 应用场景 | |------|------|----------| | SE50 | 50 bp单端 | 仅表达定量 | | PE100 | 100 bp双端 | 剪接分析（推荐） | | PE150 | 150 bp双端 | 复杂转录组 | ### 3.2 测序深度与重复数 | 分析类型 | reads/样本 | 生物学重复 | |----------|------------|------------| | 基因表达定量 | 10-30 M | **n≥3（最低）** | | 差异剪接 | 50-100 M | n≥4 | ::: {.callout-important} **黄金法则**：生物学重复 > 测序深度 ::: --- ## 4. 实验设计原则 🔑 ### 4.1 基本原则 ```markdown 1. 对照组设置 — 必须设置对照组 2. 随机化 — 样本处理顺序随机 3. 平衡设计 — 各组样本数相等 4. 盲法 — 减少操作偏差 5. 详细记录 — 批次、日期、操作者 ``` ### 4.2 常见实验设计 **两两比较（最常见）**： ``` 对照组 (n=3) vs 处理组 (n=3) ↓ ↓ 建库测序建库测序 ↓ ↓ ←—— 差异分析 ——→ ``` **配对设计**： ``` 同一患者：治疗前 (n=20) vs 治疗后 (n=20) ↓ 配对分析：考虑个体差异，提高统计效能 ``` ### 4.3 实验设计检查清单 - [ ] 每组至少3个生物学重复？ - [ ] 是否考虑了性别、年龄等混杂因素？ - [ ] 是否记录了批次信息？ - [ ] 是否进行了随机化处理？ --- ## 5. 批次效应 ⚠️ ### 5.1 什么是批次效应？ **批次效应**：由非生物学因素引起的系统性差异 | 来源 | 影响程度 | |------|----------| | **操作者** | 高 | | **时间** | 高 | | **试剂批次** | 中 | | **仪器** | 中 | ### 5.2 识别方法 - **PCA**：批次是否聚类在一起 - **热图聚类**：样本是否按批次聚类 **异常表现**：❌ 样本按批次聚类，而非生物学分组 ### 5.3 控制策略 **设计阶段控制（首选）**： ``` ✅ 推荐：块设计（Block Design） Day 1: 对照1-3 + 处理1-3 Day 2: 对照4-6 + 处理4-6 ❌ 避免： Day 1: 所有对照组 Day 2: 所有处理组 ``` **分析阶段校正**： | 方法 | 工具 | 适用场景 | |------|------|----------| | ComBat | sva包 | 已知批次 | | 纳入设计公式 | DESeq2 | 批次作为协变量 | --- ## 6. 本讲小结 | 要点 | 内容 | |------|------| | **技术优势** | 全转录组覆盖、高灵敏度、发现新转录本 | | **测序参数** | PE100-150，10-30M reads/样本，n≥3 | | **实验设计** | 对照组、随机化、平衡设计、详细metadata | | **批次效应** | **设计阶段控制优于分析阶段校正** | --- ## 思考题 1. 为什么选择poly-A富集而非随机引物？ 2. 双端测序相比单端测序的优势是什么？ 3. 如何判断实验中是否存在批次效应？ 4. 单细胞RNA-seq与常规RNA-seq在设计上的主要区别？ --- ## 参考文献 1. Wang Z, et al. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009 2. Conesa A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016 3. Leek JT, et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects. Nat Rev Genet. 2010