差异表达分析

从计数到差异基因

王诗翔副教授
中南大学生物医学信息系

2026-03-21

课程大纲

本讲内容

差异表达分析概述
RNA-seq数据统计特性
DESeq2原理与流程
edgeR简介

多重检验校正
结果解读与筛选
结果可视化
常见问题

第1部分：差异表达分析概述

1.1 什么是差异表达？

差异表达基因（DEGs）：在不同条件下表达水平发生显著变化的基因

对照组              处理组
├─┤                 ├────┤
表达量=10           表达量=20
    ↓
 Fold Change = 2

分析目标

识别处理/疾病相关的关键基因
理解生物学过程的分子机制
发现潜在的生物标志物或药物靶点

1.2 分析流程

原始counts矩阵
      ↓
  数据过滤 (低表达基因)
      ↓
  标准化 (size factors)
      ↓
  离散度估计
      ↓
  统计检验 (Wald test/LRT)
      ↓
  多重检验校正 (BH)
      ↓
  差异基因筛选 (padj < 0.05, |log2FC| > 1)

第2部分：RNA-seq数据统计特性

2.1 计数数据的分布特性

RNA-seq计数数据具有以下特点：

离散型 — 非负整数
过度离散 — 方差 > 均值
零膨胀 — 大量基因在某些样本中为0

为什么不能直接用t检验？

正态分布：均值 = 方差
RNA-seq数据：方差通常 >> 均值（过度离散）

2.2 负二项分布

负二项分布（Negative Binomial）：

均值 = μ
方差 = μ + α×μ²  (α为离散度参数)

离散度	方差 vs 均值	分布
α = 0	方差 = 均值	泊松分布
α > 0	方差 > 均值	负二项分布

实际应用： - 低表达基因：离散度高（采样误差大） - 高表达基因：离散度低（采样误差小）

第3部分：DESeq2原理与流程

3.1 DESeq2核心原理

负二项广义线性模型（GLM）：

log2(q_ij) = β_0 + β_1 × condition + ε

其中：
- q_ij：基因i在样本j中的期望计数
- β_0：截距（对照组基线）
- β_1：处理效应（log2 Fold Change）

DESeq2分析步骤

估计size factors（中位数比值法标准化）
估计基因离散度（趋势拟合）
拟合负二项GLM
Wald检验或似然比检验

3.2 Size Factor标准化

中位数比值法：

size factor_j = median_i (counts_ij / geometric_mean_i)

原理：假设大多数基因在样本间表达稳定

样本	总reads	Size Factor	说明
A	10M	1.0	基准样本
B	20M	2.0	测序深度2倍
C	8M	0.8	测序深度0.8倍

3.3 DESeq2代码示例

# 1. 创建DESeq2对象
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(
  countData = counts_matrix,
  colData = sample_info,
  design = ~ condition
)

# 2. 过滤低表达基因
keep <- rowSums(counts(dds)) >= 10
dds <- dds[keep, ]

# 3. 运行DESeq2
dds <- DESeq(dds)

# 4. 提取结果
res <- results(dds,
               contrast = c("condition", "treat", "ctrl"))

第4部分：edgeR简介

4.1 edgeR特点

同样基于负二项分布
使用经验贝叶斯估计离散度
适用于复杂实验设计

edgeR代码示例

# 创建DGEList对象
dge <- DGEList(counts = counts,
               group = condition)

# 过滤和标准化
keep <- filterByExpr(dge)
dge <- dge[keep, ]
dge <- calcNormFactors(dge)

# 离散度估计和检验
dge <- estimateDisp(dge)
et <- exactTest(dge)

4.2 DESeq2 vs edgeR

特性	DESeq2	edgeR
离散度估计	趋势拟合	经验贝叶斯
收缩性	更强	较弱
小样本稳健性	更好	中等
复杂设计	支持	支持
速度	较慢	较快

推荐： - 样本少（n=3）：DESeq2更稳健 - 样本多或复杂设计：两者均可

第5部分：多重检验校正

5.1 为什么需要校正？

假设检测20,000个基因，每个基因单独检验（α=0.05）：

假阳性期望数 = 20,000 × 0.05 = 1,000个！

Benjamini-Hochberg (BH) 方法

控制假发现率（FDR）：

FDR = E[假阳性数 / 拒绝数]

BH校正：找到最大的k，使得 p_k ≤ (k/m) × α

5.2 p值 vs FDR

指标	符号	含义	使用场景
p值	pvalue	单次检验错误概率	不推荐直接使用
调整p值	padj	FDR控制	差异基因筛选

差异基因筛选标准

推荐阈值：
- |log2FC| > 1  （倍数变化 > 2）
- padj < 0.05  （FDR < 5%）

第6部分：结果解读

6.1 DESeq2结果表

列名	含义	说明
baseMean	平均表达量	标准化后的平均reads数
log2FoldChange	log2倍数变化	处理组/对照组
lfcSE	log2FC标准误	估计的不确定性
stat	Wald统计量	检验统计量
pvalue	原始p值	未校正
padj	校正p值	BH校正后

6.2 结果分类解读

           padj < 0.05
            Yes     No
        ┌────────┬────────┐
 log2FC  │        │        │
  > 1    │ 上调   │ nominally上调 │
        │  (Up)  │        │
        ├────────┼────────┤
  -1 to 1│ 无差异 │ 无差异 │
        │        │        │
        ├────────┼────────┤
  < -1   │ 下调   │ nominally下调 │
        │ (Down) │        │
        └────────┴────────┘

第7部分：结果可视化

7.1 MA图

MA图：表达量（mean）vs 差异倍数（log2FC）

Y轴: log2 Fold Change
        ↑
    +2  │    ○ ○
        │  ○    ○
      0 ├───────────
        │  ○    ○
    -2  │    ○ ○
        ↓
        └───────────→ X轴: Mean Expression (log10)
        1      10    100

特点： - 红点：差异表达基因 - 低表达基因log2FC波动大 - 高表达基因趋于稳定

7.2 火山图

火山图：log2FC vs -log10(padj)

        ↑
-log10  │        ●●●
(padj)  │    ●●●●●●●
        │  ●●●●●●●●●
        ├──────────────
        │ -2    0    +2  → log2FC
        │
        │    ○  下调   ●  上调
        │

优点：同时展示变化倍数和统计显著性

7.3 热图

差异基因表达热图：

        Ctrl1 Ctrl2 Ctrl3 Treat1 Treat2 Treat3
Gene_A  ████  ███   ███   █████  █████  █████
Gene_B  ████  ████  ████   ███    ███    ██
Gene_C   ██    ███   ██   █████  █████  █████
        ↓                    ↓
      蓝色(低) ──────→ 红色(高)

用途：展示Top差异基因的表达模式

第8部分：常见问题

8.1 常见问题解答

Q1: 无差异基因或差异基因过多？

问题	可能原因	解决方案
无差异基因	分组错误	检查colData
	批次效应	添加批次到设计公式
	阈值过严	适当放宽阈值
差异基因过多	生物学差异大	检查样本质量
	阈值过松	使用更严格阈值

8.2 log2FC收缩

问题：低表达基因的高log2FC不可靠

DESeq2解决方案：

# log2FC收缩
resLFC <- lfcShrink(dds,
                    coef = "condition_treat_vs_ctrl")

效果： - 低表达基因：log2FC向0收缩 - 高表达基因：保持相对稳定

总结